2020年Science首秀 | 施一公首次以西湖实验室为第一单位，揭示剪接重塑的分子机制

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通过保守的ATPase /螺旋酶（包括Prp2）执行剪接体重塑，可进行Pre-mRNA剪接。但是，ATP酶/螺旋酶功能的结构基础仍然知之甚少。

2020年11月27日，西湖实验室（浙江省政府批准设立的省实验室，依托西湖大学），西湖大学，清华大学等多单位合作，施一公及万蕊雪共同通讯在Science 在线发表题为“Mechanism of spliceosome remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its coactivator Spp2”的研究论文，该研究报告了Prp2，共激活因子Spp2复合的Prp2和装载Prp2的活化剪接体的原子结构，以及结构指导的生化分析的结果。

Prp2与剪接体弱结合，没有Spp2就无法发挥功能，而Spp2与Prp2和剪接体上的锚分子稳定缔合，从而将Prp2束缚到活化的剪接体上并允许Prp2起作用。Pre-mRNA被加载到Prp2的N-和C-半之间的特征通道中，其中N-half的Leu536和C-half的Arg844阻止了pre-mRNA向其5'端的向后滑动。ATP结合和水解触发Prp2中的域间移动，从而驱动pre-mRNA朝其3'端单向逐步转移。这些保守的机制解释了剪接体重塑与Pre-mRNA剪接的耦合。

另外，2020年5月6日，施一公团队（清华大学为第一单位）在Cell Research 在线发表题为”Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex by cryo-electron microscopy single particle analysis“的研究论文，该研究介绍了非洲爪蟾NPC CR的单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，平均分辨率为5.5-7.9–Å，局部分辨率达到4.5Å。改进的分辨率允许在大多数CR组件中标识和放置辅助结构元素。每个CR亚基中的两个Y复合物彼此相互作用，并与侧翼亚基的Y复合物缔合，形成圆形支架。在每个CR亚基中，含有Nup358的区域包裹着两个Y复合物的茎，可能稳定了支架。Nup205连接两个Y配合物的短臂，并与相邻Y配合物的茎相连。包含Nup214的区域使用延伸的卷曲螺旋连接两个Y络合物的Nup85，并突出到NPC的轴向孔中。这些以前没有特征的结构特征揭示了对NPC组装的了解。

2020年5月4日，施一公团队(西湖大学为第一单位)在Cell Research 在线发表题为”Molecular architecture of the luminal ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex“的研究论文，该研究报告了非洲爪蟾卵母细胞的NPC的腔环（LR）的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结构。LR的观察到的关键结构特征可通过单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）分析独立确认。该研究揭示了LR以前未知的特征，并可能解释了NPC的弹性。

Pre-mRNA剪接是通过剪接体实现的，剪接体是一种异常活跃的核糖核蛋白机制。在每个剪接循环中，剪接体都要经历四个连续的阶段：组装，活化，催化和拆卸。在组装过程中，pre-mRNA被U1小核糖核糖核蛋白（snRNP）识别，形成早期复合物（E）。E复合物与U2 snRNP缔合以构成前剪接体（A），其结合U4 / U6.U5 tri-snRNP形成前体剪接体（B前体）。除了pre-B以外，组装的剪接体还具有七个主要功能状态：催化前剪接体（B），活化剪接体（ Bact），催化活化剪接体（B *），步骤I配合物（C），步骤II活化的配合物（C * ），催化后配合物（P）和内含套索状剪接体（ILS）。

在每个剪接循环中，相邻状态之间的剪接体重塑是由八个保守的ATPase /螺旋酶执行的，每个酶在Pre-mRNA剪接中都起着不可或缺的作用。剪接反应包括两个步骤：分支和外显子连接，分别在B *和C *复合物中进行。因此，分支严格依赖于 Bact-to-B *重塑。

Prp2与其包含共激活因子Spp2的G-patch域一起，利用ATP结合和水解的能量将3'-to-5'转移到单链pre-mRNA上，从而移动pre-mRNA。mRNA朝向其3'末端。这一运动触发了SF3复合物和其他几种蛋白质的解离并募集了两个剪接因子，从而将 Bact复合物重塑为B *复合物。与Prp2相似，Prp43的正常功能可以分解ILS复合体，它还需要包含共激活因子Ntr1的G Patch结构域。

对Pre-mRNA剪接的机制理解不仅需要详细的结构信息，还需要剪接体的活性位点中心，而且还需要有关ATPase /螺旋酶的作用，从而协调剪接体的重塑。自2015年以来，已经以接近原子的分辨率确定了剪接体几乎所有主要功能状态的冷冻电子显微镜（EM）结构，从而在剪接循环的编排过程中生成了静态图像。

然而，由于分辨率的限制，剪接体中的ATPase /螺旋酶在原子细节上均未显现，并且对pre-mRNA的识别尚无结构证明。因此，很大程度上仍然不清楚Prp2如何重塑 Bact复合物以及Prp2为什么需要其共激活因子Spp2。

为了解决这些关键问题，该研究首先确定了酿酒酵母 Bact复合物的冷冻EM结构，分辨率为2.5Å（完整剪接体实现的最高分辨率），从而可以在鉴定了12种新蛋白质，包括Prp2和Spp2。结构揭示以及生化分析阐明了Spp2激活Prp2的机制。然后，改研究进行了第二轮结构研究–这次是针对三个不同功能状态的Prp2：自由Prp2，绑定Spp2的Prp2和ADP，Spp2及Prp2。这些结构以及已发布的信息揭示了Prp2重塑 Bact复合体的作用机制。

参考消息：

https://science.sciencemag.org/content/early/2020/11/24/science.abe8863

编者按：本文转载自微信公众号：iNature（ID：Plant_ihuman），作者：枫叶