重大突破！《Nature》子刊：新型显微镜无创实现小鼠头骨下神经突触成像

作者|高分子科学前沿 来源|高分子科学前沿(ID：Polymer-science)

自从一百年前X射线用于医学诊断，越来越多的物理技术被运用到医学中用于检测，成像。但这些传统技术都存在一些局限性，要么是高能射线或者采样对人体带来一定的损伤，要么在观测尺寸和清晰度上受到限制。共焦成像是深组织光学显微术中应用最广泛的一种成像方法，它能有效地抑制来自失焦平面的信号以及多次光散射产生的其他无用噪声。但是像颅骨这样厚度不一的组织结构会引起复杂的像差，并且随着成像深度的增加，分辨率会因为散射光线的遮挡而逐渐降低，神经系统的细微结构难以显现。对于颅骨这样的组织成像，通常需要削薄颅骨或者开颅窗，这样侵入性的成像技术往往会带来一定的组织损伤的风险。

近日，韩国首尔基础科学研究所分子光谱与动力学中心Choi Wonshik教授课题组，在深层组织光学成像上有了重大突破。研究者们开发了一种激光扫描反射矩阵显微镜（LS-RMM），这种显微技术基于传统激光扫描共聚焦显微镜以及硬件和计算自适应光学（AO）。该技术可以通过完整的小鼠头骨成像，实现神经突触的成像，图像的极限空间分辨率估计为450 nm并且无需光引导。作者还演示了通过物理校正从反射矩阵识别出的像差，神经元树突及其棘突的双光子荧光（TPF）成像。该工作以“Laser scanning reflection-matrix microscopy for aberration-free imaging through intact mouse skull”为题发表在《Nature communications》上。

激光扫描反射矩阵显微镜的实验原理图

Figure 1. 激光扫描反射矩阵显微镜的实验原理图。

LS-RMM与光学相干显微术(OCM)系统建立在相同的主干网上，但在检测方案上有所不同。(Figure 1.a)将摄像机放置在与像平面共轭的平面上(代替了共焦针孔和光电探测器)，在摄像机中引入参考波，形成离轴低相干干涉法，然后从干涉图中检索回样品中反散射波的时间门控电场图像。在没有像差的情况下，获得的时控电场场图像在衍射限制的光斑尺寸为450 nm时被清晰聚焦。相反，在存在畸变介质时，强度图显示出明显的增宽分布，峰值强度几乎衰减了两个数量级。同时，相应的相位图也显示了有意义的相位值的加宽分布。(Figure 1.b,c,d,e)

图像处理和像差校正

Figure 2. 用时间分辨反射矩阵校正像差。

在光学相干反射成像中，入射波在到达样品的路上和反射波在返回探测器的路上的样品诱导像差必须分别识别，这几需要记录反射矩阵并应用计算自适应光学CLASS算法。对反射矩阵R使用CLASS算法，与原始OCM图像相比，像差校正图像的强度平均提高了约30倍。校正图像的空间分辨率估计为450 nm，与理想衍射极限相同。(Figure 2.c,d,e,f,g,h,i)与传统的计算AO相反，该方法的校正模式的数量与图像分析面积不会成比例地减少。即使将图像分析区域缩小到等平面斑块尺寸为10×10µm^2时，校正模式的数量也可以保持在全FOD(~10,000)的角度模式下。

LS-RMM系统的设计不仅可以识别介质引起的高阶像差，还可以对其进行物理补偿，从而在样品上产生近衍射极限聚焦。实验设置中的SLM用于显示已识别输入像差图的相位共轭，以补偿入射到样品和从样品出射的波的波前畸变,从而得到更干净的OCM图像。(Figure 2.j,k)

通过完整颅骨的小鼠大脑的活体成像

Figure 3. 通过小鼠颅骨的髓鞘轴突成像。

小鼠头骨由细微结构组成，这些细微结构会引起严重的光学像差以及强烈的多重散射噪声。通常情况下，传统的双光子显微镜如果不将脑组织从头骨中完全取出，就无法解析树突棘的精细结构。使用激发波长超过1300nm的光学成像技术可以透过颅骨成像，但是往返相差共同降低了图像质量。与削薄小鼠颅骨相比，完颅骨情况下获得OCM图像是不能分辨出轴突的，但是使用CLASS算法优化抵消颅骨畸变带来的影响后就可以分辨。(Figure 3.b,c,f,g)

通过完整小鼠颅骨的近衍射限制TPF成像

Figure 4. 通过完整小鼠颅骨的TPF成像。

LS-RMM可直接与多光子显微镜（例如TPF显微镜和二次谐波生成（SHG）显微镜）组合使用，以恢复其在深组织成像中受衍射限制的空间分辨率。研究者演示了通过完整颅骨的神经元树突的近衍射限制TPF成像。使用CLASS算法恢复轴突的精细结构并且获得子区域的像差图。(Figure 4.a,b,c)常规的TPF没有像差校正，研究员使用OCM图像中获得像差图对于TPF图进行校正，获得了19倍的荧光增强。(Figure 4.c,d,e,f,g,h,i)

总结

作者开发了激光扫描反射矩阵显微镜（LS-RMM），并简化了单散射（CLASS）算法的闭环累积，即使在存在多次强散射噪声的情况下也可以校正局部高阶像差。该系统与传统的激光扫描共焦显微镜高度兼容，但它不同于传统的共焦成像，该系统可检测到到达非共聚焦和共聚焦位置的反向散射信号。作者展示了活小鼠的完整颅骨引起的复杂局部像差的皮质髓鞘形成的无标签反射成像和空间分辨率为500 nm的神经元树突及其微小棘的TPF成像，这也是首个穿透头骨的反射成像。LS-RMM可以采用任何激发波长，类似于共焦反射成像。使用更长的激发波长有助于增加成像深度，以减少多次散射噪声。另外波前像差的识别是基于目标的内在反射率对比度来实现的，因此不需要荧光标记和高的激发功率。LS-RMM的硬件像差校正能力也可以加入到其他成像方式中，如超分辨率成像和相干拉曼成像，以增强其在深部组织成像中的成像深度。而对于CLASS算法时间复杂度的优化也可以通过使用图形处理单元或基于集群的硬件来优化。

编者按：本文转载自微信公众号：高分子科学前沿(ID：Polymer-science)