更安全、更少脱靶，精确度可增强93倍！温州医科大学谷峰团队筛选出saCas9变体，为更安全的基因治疗指明方向

作者|nagashi  来源|BioWorld(ID：ibioworld)

CRISPR-Cas9系统是一种十分强大的基因组编辑工具，近年来，CRISPR-Cas9技术通过Cas蛋白靶向基因突变位点并将其纠正，在基因治疗领域展现出极大的潜力。然而，脱靶效应依旧是一个亟待解决的难题。

具体来说，在某些情况下，Cas9蛋白的核酸酶活性可以通过向导RNA（gRNA）靶向不完全匹配的、脱靶的基因组位点而触发，并且这一问题在失配位点在PAM序列远端时尤为严重，这极大地影响了CRISPR-Cas9碱基编辑器的临床应用。

近日，温州医科大学眼视光学和视觉科学国家重点实验室的谷峰教授团队在 PLOS Biology 杂志上发表题为：High-fidelity SaCas9 identified by directional screening in human cells 的研究论文。

该研究通过一种定向筛选系统识别在人类细胞中具有低脱靶率特征的SaCas9突变体，并报告了具有N260D点突变的SaCas9 (efSaCas9)可以有效地区分单碱基对不匹配，提高了基因编辑的精确度。

为了解决CRISPR-Cas9碱基编辑器的脱靶效应，科学家们采取了各种策略，包括使用Cas9 nickase突变体生成一对并列的单链DNA缺口，使用一对失活的Cas9融合FokI核酸酶域，构建Cas9的核糖核蛋白体(RNP)以及删除引导序列的5’末端，但这些方法或多或少都存在着缺陷。

2015年8月，张锋等人在Cell发表论文，从金黄色葡萄球菌中发现了saCas9，saCas9长度仅1053个氨基酸，相比1368个氨基酸长度的spCas9，saCas9能更好地通过腺相关病毒（AAV）递送，用于体内基因治疗。

之前有研究报道了通过结构引导的合理设计或随机诱变酵母获得高保真度CRISPR-SpCas9突变体。然而，到目前为止，直接从人类细胞中鉴定出的SaCas9高保真度突变还未见报道。

在此项研究中，研究团队使用体内EGFP荧光报告系统，首先在单核苷酸水平对野生型(WT) SaCas9 的脱靶效应进行描述——他们观察到某些不匹配的sgRNA也可以显著激活野生型 SaCas9 脱靶切割活性。

为了减少SaCas9的脱靶效应，研究人员使用了一种定向筛选系统，它可以高效地选择具有期望特性和性状的SaCas9突变体。该系统基于人类细胞的EGFP荧光报告系统定量、可重复地快速评估变异体的活性和保真度。

研究团队识别出具有N260D点突变的efSaCas9（Mut268），它可以有效地区分单碱基对不匹配。靶向深度测序分析表明，与野生型相比，Mut268显著降低了脱靶效应，精确度最高可以增强93倍。

除此之外，研究人员还探究了Mut268保真度增强的结构来源，他们发现位于REC3区域的N260协调了REC3与gRNA-DNA杂合双链之间广泛的接触网络，这一位点的突变可以削弱两者的接触，从而确保只有序列完全配对才能触发酶的切割活性。

对此，通讯作者谷峰教授表示：“克服脱靶效应是CRISPR应用于医学领域的一个关键挑战，例如纠正遗传疾病或靶向癌细胞，我们的研究结果为开发更安全的基因治疗策略指明了方向。”

总而言之，谷峰教授团队描述了野生型 SaCas9 具有明显的脱靶效应，并通过定向筛选系统在人类细胞中识别出一种具有低脱靶率特征的SaCas9突变体——efSaCas9，其N260D点突变使得SaCas9具有更高的保真度。

除此之外，此项研究还提供了一种通用策略来快速开发具有不同特性的CRISPR-Cas9，以此扩展CRISPR的工具包和应用范围。

论文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000747

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